Die meisten Fledermausarten ernähren sich von Insekten (Gliederfüßer), die sie teilweise im Flug erbeuten. In den Tropen und Subtropen gibt es viele vegetarisch lebende Arten, die Früchte fressen oder Nektar trinken. Diese Arten spielen eine wichtige Rolle für die Pflanzen, deren Blüten sie bestäuben (Chiropterophilie) und deren Samen sie verbreiten (Chiropterochorie).

Größere Arten der Gattungen Megadermatidae, Nycteridae und Phyllostomidae fressen auch kleinere Säugetiere wie Nagetiere und andere Fledermäuse, kleinere Vögel, Frösche, Mäuse und Fische. Die größten Arten wie Vampyrum spectrum fressen Vögel bis zur Größe von Tauben. Unter anderem dienen die von der Beute ausgestoßenen Laute wie auch deren Geruch zur Identifikation. Die drei Arten der Vampirfledermäuse (Desmodontinae) ernähren sich vom Blut anderer Tiere.

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